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什么是 FLIM 荧光寿命成像?

简介：

文章要点:

1.荧光寿命成像（FLIM）技术用于测量整个样品荧光寿命的变化。

2.使用脉冲激光器和时间相关单光子计数（TCSPC）来记录FLIM图像。

3.荧光寿命成像（FLIM）提供了传统荧光强度成像无法获得的额外信息。

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荧光寿命的概念为什么使用FLIM FLIM采集和分析相关产品

荧光寿命的概念

荧光寿命是指荧光分子在激发态停留的时间，这个时间可以反映荧光分子的内在属性和所处的微环境，与局部荧光团浓度和激发强度无关。荧光寿命成像（Fluorescence Lifetime Imaging ，FLIM)）是一种重要的荧光显微镜技术，通常用于研究生物分子间相互作用、细胞中的信号事件或区分光谱重叠的荧光团。此外，FLIM 可以提供有关电信号变化、离子和氧含量、温度、细胞或其环境中的 pH 值的定量信息。FLIM技术因具有非常高的灵敏度和分子特异性而广泛的应用生物学研究及临床诊断等领域。

图 Perrin-Jablonski能级示意图所示，荧光是分子吸收能量后，基态电子被激发到单线激发态后从第一单线激发态回到基态时所产生的，而荧光寿命是指分子在单线激发态平均停留的时间。分子中处于单线态的基态电子能级S0上的电子，根据Frank-Condon规则吸收某一波长的光子后，被激发到单线态的激发态电子能级S1中的某一个振动能级上，这个过程的时间约为10^-15 s；经过短暂的振动驰豫过程后（时间约10^-12~10^-10 s），S1态的最低振动能级上会积累大量的电子。这一状态的电子释放能量回到基态S0能级。

FLIM的黄金标准是时间相关单光子计数（TCSPC）。TCSPC利用快速秒表测量激发脉冲与探测荧光之间的时间差。使用高重复脉冲激发光激发样品，在每一个脉冲周期内，最多激发荧光分子发出一个光子，然后记录光子出现的时刻，并在该时刻记录一个光子，再下一个脉冲周期内也是相同的情况，经过多次计数可以得到荧光光子随时间的分布曲线。

为什么使用FLIM

荧光寿命成像（FLIM）是一种成像技术，样品荧光寿命的变化在图像中产生对比度（图1）。FLIM广泛用于生物医学成像，其中组织和细胞用一种或多种荧光染料染色。染料的荧光寿命取决于局部微环境，FLIM比其他成像技术（如宽场成像）提供了额外的维度，如环境信息。FLIM也越来越多地用于研究光致发光材料，例如对纳米材料、太阳能电池和半导体的载流子寿命变化进行成像。

图1 使用RMS1000共聚焦显微拉曼光谱仪测量（a）小鼠肠道切片和（b）小鼠肾脏切片的FLIM图像。

FLIM采集和分析

FLIM采集

荧光衰减是使用时间相关单光子计数（TCSPC）获得的。在TCSPC中，用脉冲激光激发样品，并测量激光脉冲和检测到的荧光光子之间的时间（图2a）。该过程重复数百万次，以创建荧光光子计数与到达时间的直方图（图2b）。

将样品上感兴趣的区域划分为像素，并使用TCSPC记录每个像素的荧光衰减（图2c）。通过移动样品台（样品台扫描）或激光点（激光扫描）将激光点引导到每个像素上。这个过程按顺序发生，依次记录每个像素的荧光衰减，以构建直方图数据合集。

图2 （a）使用TCSPC记录单个光子到达时间；（b）单个像素的荧光衰减直方图；（c）感兴趣区域内逐个记录像素的荧光衰减直方图。

FLIM分析

计算每个像素荧光衰减直方图的荧光寿命。通常用最小二乘法将单指数模型拟合到每个衰减来计算，以获得荧光寿命τ（图3）。将通过拟合获得的荧光寿命对应到颜色图上，构建颜色编码的荧光寿命图像。

图3 计算FLIM数据，每个像素的荧光寿命对应颜色变化，构建颜色编码的荧光寿命图像。